Сравнение конфокальной и мультифотонной микроскопии для визуализации тканей в глубине образца

Среди современных методов микроскопии ключевую роль в получении более чётких и информативных изображений из глубины образца сыграли конфокальная и мультифотонная микроскопия. Оба метода обладают существенными преимуществами, однако распространённые заблуждения относительно области их оптимального применения нередко приводят к неэффективному использованию.

В данной статье мы последовательно рассмотрим визуализацию на различных глубинах образца и покажем, в каком диапазоне возникает «разрыв» в качестве изображения — и каким образом RAYSHAPE от abberior, система динамической коррекции аберраций, позволяет его устранить, обеспечивая высокую яркость и чёткость изображения.

Перемещение вдоль оси Z: первые 20 мкм

При увеличении глубины визуализации в тканевом образце доминирующими источниками искажений становятся различные оптические эффекты.

Начнём с приповерхностной области. В таблице 1 представлен обзор искажений изображения и применимых методов микроскопии на различных глубинах.

На глубинах от нескольких микрометров до приблизительно 20 мкм как конфокальная, так и мультифотонная микроскопия позволяют получать изображения высокого качества, поскольку ограничивают вклад либо детектируемого излучения, либо возбуждающего света исключительно фокальной плоскостью. Это приводит к подавлению паразитных сигналов, возникающих выше и ниже фокуса.

Таблица 1. Искажения изображения и ограничения различных методов микроскопии в зависимости от глубины визуализации образца

Глубина визуализации	Доминирующий источник искажений	Доступные методы микроскопии
0–20 мкм	Излучение от областей образца вне фокуса	Конфокальная: применима, но с ограниченным разрешением
		STED: применима (2D), обеспечивает сверхразрешение
		Мультифотонная: применима, но требует дорогостоящего оборудования и вызывает интенсивное фотообесцвечивание
20–200 мкм	Преломление света	Конфокальная: требует постоянной коррекции при изменении глубины фокуса
		STED: требует постоянной коррекции при изменении глубины фокуса
		Мультифотонная: фотообесцвечивание превышает выигрыш в качестве изображения
>200 мкм	Рассеяние света	Конфокальная: применение затруднено
		STED: применение затруднено
		Мультифотонная: уменьшает вклад рассеянного света и является предпочтительным методом, несмотря на высокое фотообесцвечивание

Принципы работы конфокальной и мультифотонной микроскопии

Конфокальная микроскопия: формирование оптического среза

Конфокальная микроскопия уменьшает вклад фоновой флуоресценции от областей образца вне фокуса за счёт пространственной фильтрации регистрируемого сигнала с помощью пинхола (апертурной диафрагмы), который блокирует расфокусированное излучение. В результате регистрируется флуоресценция, исходящая преимущественно из области, близкой к фокальной плоскости, что обеспечивает оптическое секционирование образца.

Путём последовательного сканирования по оси Z и последующего объединения оптических срезов формируется трёхмерное изображение структуры образца.

Конфокальная микроскопия эффективно работает с умеренно рассеивающими образцами толщиной до ~200 мкм. Однако при увеличении глубины сканирования или плотности ткани эффективность использования пинхола снижается: оптические аберрации приводят к тому, что часть фотонов, испущенных в фокальной плоскости, не проходит через пинхол, тогда как фотоны из внефокусных областей, наоборот, могут быть зарегистрированы. В результате интенсивность полезного сигнала уменьшается, а уровень фонового шума возрастает.

Мультифотонная микроскопия: визуализация на больших глубинах

Мультифотонная микроскопия была разработана как ответ на ограниченную глубину проникновения конфокальной микроскопии и демонстрирует наилучшие результаты при визуализации на миллиметровых глубинах в сильно рассеивающих средах (рис. 1).

Подобно пинхолу в конфокальной микроскопии, мультифотонная микроскопия обеспечивает пространственное ограничение сигнала по глубине — интенсивность возбуждения уменьшается пропорционально 1/z², где z — расстояние от фокальной плоскости. Однако принципиальное отличие заключается в том, что в мультифотонной микроскопии ограничивается область возбуждения, а не детектирования.

Рисунок 1. В конфокальной микроскопии возбуждение флуорофоров происходит также выше и ниже фокальной плоскости, тогда как в мультифотонной микроскопии суммарное возбуждение локализовано в очень узком диапазоне по оси Z.

Возбуждение осуществляется за счёт одновременного поглощения несколькими низкоэнергетическими фотонами, которые достигают флуорофора практически одновременно (в пределах нескольких фемтосекунд) и совместно обеспечивают переход на возбуждённый электронный уровень, эквивалентный поглощению одного фотона с более высокой энергией (рис. 2).

Используемые длины волн возбуждения находятся в красной и ближней инфракрасной области спектра и обладают примерно вдвое меньшей энергией по сравнению с однофотонным возбуждением в конфокальной микроскопии. Один лазерный источник может одновременно возбуждать флуорофоры с различными спектрами излучения. Оптическое секционирование достигается за счёт пространственной локализации возбуждения, а испущенная флуоресценция эффективно регистрируется детектором без необходимости использования пинхола.

Рисунок 2. Диаграмма Яблонского для однофотонного возбуждения (конфокальная микроскопия) и двухфотонного возбуждения (двухфотонная микроскопия). Энергия возбуждающих фотонов при двухфотонном процессе вдвое меньше, чем при однофотонном возбуждении.

За пределами 20 мкм: роль аберраций и рассеяния

Как отмечалось выше, первые 20 мкм образца эффективно визуализируются с помощью конфокальной и сверхразрешающей микроскопии. При необходимости субдифракционного разрешения STED-микроскопия обеспечивает исключительно высокое качество изображения. В этом диапазоне глубин использование мультифотонной микроскопии, как правило, экономически и методически неоправданно, учитывая высокую стоимость ультракороткоимпульсных лазеров.

На глубинах более 20 мкм существенное влияние начинают оказывать оптические аберрации, обусловленные преломлением света на границах сред с различными показателями преломления. В конфокальных и мультифотонных микроскопах частичная компенсация таких аберраций возможна с помощью коррекционного кольца объектива, однако эта коррекция фиксирована и эффективна лишь в узком диапазоне глубин (несколько микрометров по оси Z). Изменение параметров коррекции в процессе сканирования невозможно, что делает недостижимой однородную коррекцию по всей толщине оптического среза.

Кроме того, в мультифотонной микроскопии в диапазоне 20–200 мкм наблюдается интенсивное фотообесцвечивание образца, обусловленное высокими плотностями возбуждения, необходимыми для регистрации сигнала [Singh A. et al., 2015]. В этом диапазоне потери от фотообесцвечивания превышают выигрыш в качестве изображения.

При глубинах более 200 мкм доминирующим фактором деградации изображения становится многократное рассеяние света, и коррекция аберраций, связанных с преломлением, перестаёт быть эффективной. В этих условиях мультифотонная микроскопия демонстрирует наилучшие результаты, особенно при исследовании липид-насыщенных тканей, таких как нервная ткань. Использование длинноволнового возбуждения снижает рассеяние и обеспечивает более высокий контраст изображения, несмотря на повышенное фотоповреждение образца.

Заполнение «провала» в диапазоне глубин

Таким образом, при анализе возможностей различных методов вдоль оси Z становится очевидным наличие промежутка, в котором невозможно получить высококачественные изображения по всей глубине образца. До 20 мкм эффективно работают конфокальная и STED-микроскопия, а начиная с ~200 мкм оптимальным выбором становится мультифотонная микроскопия. Однако в диапазоне между этими значениями традиционные методы оказываются ограниченными.

Идеальным решением является система, способная динамически адаптироваться к аберрациям по мере перемещения фокальной плоскости вдоль оси Z и в реальном времени корректировать волновой фронт.

Рисунок 3. Пример глубокой визуализации тканей с использованием системы RAYSHAPE. Без коррекции аберраций xz-срез эмбриона Drosophila (стадия 17) быстро теряет яркость и контраст с увеличением глубины (слева). При использовании RAYSHAPE деформируемое зеркало динамически компенсирует аберрации во время сканирования, обеспечивая равномерно яркое и чёткое изображение по всей глубине (справа).

От искажений к высокой чёткости: микроскопия с RAYSHAPE

Интеграция системы RAYSHAPE в конфокальные и STED-микроскопы позволяет получать яркие изображения с высоким разрешением на глубинах от нескольких микрометров до приблизительно 200 мкм. Массив из 140 независимых актуаторов управляет деформируемым зеркалом, оптимизируя фокусировку возбуждающего пучка и компенсируя аберрации в регистрируемом излучении по мере перемещения фокальной плоскости внутри образца.

Благодаря миллисекундному времени отклика и высокой точности управления коррекция осуществляется динамически, что обеспечивает стабильное качество изображения даже в глубоких слоях образца. Дополнительным преимуществом является снижение фотонной нагрузки на образец и флуорофоры.

Вывод

Для образцов толщиной до 200 мкм конфокальная или STED-микроскопия с системой RAYSHAPE обеспечивает высокое качество изображения по всей глубине. STED при этом позволяет дополнительно достичь сверхразрешения. Для образцов толщиной более 200 мкм и до нескольких миллиметров мультифотонная микроскопия остаётся предпочтительным методом благодаря снижению влияния рассеяния, несмотря на повышенное фотоповреждение образца.