Арт. STEDYCON
Более века мы стояли на краю разрешения микроскопа и проклинали неумолимое размытие дифрагированного света. Приборы совершенствовались, но туман не рассеивался. Затем один человек перестал пытаться контролировать поведение света. Вооружившись лазерным лучом в форме пончика, он стал управлять тем, куда он светит, и навсегда избавился от проблемы разрешения.
В отличной форме
Форма пончика кажется обыденной. Возможно, это потому, что мы видим его повсюду. Конечно же, это прекрасная выпечка. Он также двигает автомобили по дороге, обеспечивает безопасность детей в бассейнах, может украсить мочку уха, палец или даже дверь дома в декабре. Но пончик примечателен своей простотой.
Тор - или пончик - образуется при вращении круга вокруг оси, которая лежит в плоскости и вне круга
Пожалуй, пончик - не самая распространенная форма в природе. Это отличие может принадлежать сфере капель дождя или шестиугольнику сот и снежинок. Однако пончик или тор - это форма силы. Вспомните радиационные пояса Земли, состоящие из заряженных частиц, захваченных солнечным ветром. Они формируются в торы (это множественное число от слова "тор") под действием биполярного магнитного поля Земли. Торы - это также выбранная форма токамака, плазмообразующего реактора, который когда-нибудь сможет производить энергию путем ядерного синтеза. А в оптической микроскопии пончик нанес мощный удар по упрямой парадигме, ограничивавшей разрешение микроскопов на протяжении десятилетий.
Свет - это самовлюбленная знаменитость
Среди стимулов, которые эволюция выбрала для нашего восприятия мира, свет похож на самовлюбленную знаменитость. Свет тщеславен. Никто не может двигаться быстрее нее. Свет также капризен. Он отказывается принимать решение о том, быть ему частицей или волной. Этот последний каприз досаждает оптической микроскопии. Каким бы сложным ни был прибор, точка света, рассматриваемая через микроскоп, становится размазанным пятном, потому что световые волны, проходящие через апертуру объектива, дифрагируют. В результате, когда две точки света находятся достаточно близко, чтобы размазанные пятна накладывались друг на друга, мы не можем их различить. То есть, существует неотъемлемый предел разрешения микроскопа, продиктованный самой природой сигнала, который он обнаруживает. В микромасштабе это не имеет значения. Диаметр мазка находится в диапазоне сотен нанометров. Однако увеличить масштаб, чтобы рассмотреть мельчайшие вещи - например, молекулы, прыгающие в клетках, - невозможно. В 1873 году физик Эрнст Карл Аббе сказал нам, что лучшее, что мы можем сделать, это разрешить объекты, находящиеся на расстоянии около 200 нм друг от друга. Это в 100 раз больше, чем размер молекулы. Все молекулы в пределах 200 нм друг от друга выглядят под микроскопом как единое целое. Этот непреложный факт, называемый дифракционным барьером Аббе, буквально высечен на камне в Йенском университете имени Фридриха Шиллера в Германии, и десятилетиями микроскописты вздыхали с покорностью.
Согласно дифракционному пределу Аббе, объекты должны находиться на расстоянии около 200 нм друг от друга, чтобы их можно было различить под световым микроскопом
Лазейка порождает инновации
Конечно, за последнее столетие микроскопы стали лучше. Флуоресцентная конфокальная микроскопия творила чудеса, раскрывая внутреннюю работу клеток. Однако разрешение оставалось на пределе Аббе. Так было до тех пор, пока в 1990-х годах кто-то не решил эту проблему под другим углом. Вместо того чтобы пытаться изменить оптику микроскопа, доктор Стефан Хелл воспользовался лазейкой, чтобы перехитрить высокомерие света и преодолеть барьер разрешения.
Хелл работал с флуоресцентными микроскопами. В них интересующие нас молекулы в образце помечаются крошечными флуоресцентными зондами или флуорофорами. Флуоресцентный микроскоп направляет свет на зонды, приводя их в состояние возбуждения, а затем регистрирует фотоны, которые они испускают при возвращении в исходное состояние. Сосредоточение внимания на этой разнице в состояниях и было сутью лазейки Хелла. Он рассуждал так: пучок возбуждающего света проецируется на фокальную плоскость образца в размахе примерно 200 нм. Все флуорофоры в этом диапазоне возбуждаются, испускают фотоны, и поэтому любые структуры размером менее 200 нм неразличимы. Таким образом, для улучшения разрешения некоторые из этих флуорофоров должны быть сняты с возбуждения.
Вслед за возбуждением Хелл пустил второй луч света в форме пончика. Этот второй луч имел длину волны, которая сбивала возбужденные флуорофоры обратно в их основное состояние. Таким образом, все флуорофоры в области, имеющей форму пончика, были заглушены, и эффективная область детектируемой эмиссии фотонов была ограничена отверстием пончика. Перемещение пончика над образцом позволило получить изображение с субдифракционным разрешением.
Вот! Обычный пончик увеличил разрешающую способность микроскопов в десять раз и положил начало области микроскопии сверхразрешения.
STED-лазер сужает область разрешенного излучения флуорофора примерно до 20 нм, обеспечивая разрешение в субдифракционном диапазоне. Новаторское изобретение Стефана Хелла создало область микроскопии сверхвысокого разрешения
Всевозможные идеи
Прорывная технология Хелла, которую он назвал стимулированным истощением эмиссии (STED), первой открыла двери в наноскопический мир. Позже другие техники также работали вокруг дифракционного предела Аббе, используя вариации подхода. Вскоре сверхразрешение легло в основу многочисленных разработок в области микроскопии, а его влияние было отмечено Нобелевской премией в 2014 году.
Хелл разделил Нобелевскую премию с Уильямом Мёрнером и Эриком Бетцигом, которые в 2006 году достигли субдифракционного разрешения с помощью метода, названного микроскопией локализации одиночных молекул (SMLM). Как и STED, этот метод использует различные состояния флуоресцентных зондов. Разница между этими технологиями заключается в том, как они локализуют зонды. STED определяет местоположение флуорофоров путем ограничения области, в которой им разрешено излучать фотоны - таким образом, местоположение определяется до получения изображения. SMLM не делает ничего подобного. Вместо этого он случайным образом возбуждает отдельные флуорофоры и записывает их индивидуальный, размазанный эмиссионный сигнал. Именно так. Точно так же, как свет, падающий на образец, размазывается, свет, возвращающийся от образца, размазывается за счет дифракции. Изменения в интенсивности пикселей в одном, не перекрывающемся пятне статистически предсказуемы. Поэтому, чтобы точно определить местоположение флуорофора, SMLM подгоняет кривую вероятности локализации к интенсивности пикселей мазка. То есть, местоположение определяется после визуализации.
SMLM-микроскопы локализуют сигнал с помощью зонного детектора. Из-за дифракции света обнаруженный сигнал размывается до ширины около 200 нм, этот эффект называется функцией рассеяния точек (PSF). Гауссова кривая подгоняется к PSF для определения вероятного положения начала сигнала в виде набора координат с некоторой неопределенностью. Этот пространственный диапазон и есть эффективная PSF.
Хотя оба метода доступны на рынке и широко используются, ни один из них не позволяет достичь разрешения намного лучше, чем 20 нм. Это не позволяет нам достичь нашей цели - различить отдельные молекулы. Что ограничивает их эффективность, так как это зависимость от большого количества фотонов. Разрешение можно было бы улучшить, если бы эта зависимость была инвертирована. Итак, в мире технологий, которые ищут максимумы фотонного излучения, как использовать меньшее количество фотонов?
Переворачивая концепцию пончика
Хелл не тот человек, который будет довольствоваться незавершенными работами. Он не хотел просто преодолеть дифракционный барьер. Он хотел продвинуть разрешение как можно дальше. Его целью было одноразрядное наноразмерное разрешение. Он понимал важность количества фотонов для разрешения и был разочарован фотонным обжорством STED и SMLM. Итак, спросил он, есть ли лучший способ? Ответ заключался в том, чтобы перевернуть работу "пончика" с ног на голову.
Вернемся к лучу в форме пончика, используемому в STED для глушения флуорофоров, и подумаем, что произойдет, если использовать его для их возбуждения. Флуорофор в кольце будет излучать свет, но в самом центре пончика - в нуле - вы не получите ничего. Как глаз бури, центр неподвижен. Находящийся там флуорофор не возбужден. Темно. Нет эмиссии. Теперь переместите пончик так, чтобы флуорофор приблизился к кольцу возбуждающего света. Вероятность того, что флуорофор возбудится и испустит фотон, увеличивается тем больше, чем дальше перемещается пончик. Фактически, эта вероятность имеет форму параболы. Она высока, когда флуорофор возбуждается на одной стороне пончика, затем падает до нуля, когда флуорофор проходит через центральное отверстие, а затем снова возрастает на другой стороне пончика.
Вспомните слабые воспоминания о математике, и вы вспомните, что квадратичное уравнение описывает эту параболу, а минимум этого уравнения находится в нулевой точке пончика. Таким образом, перемещая "пончик" возбуждающего света и обнаруживая только два эмиссионных сигнала, по одному на каждом конце параболы, вы можете точно определить флуорофор. Пончик ограничивает возможное местоположение только областью своего отверстия и предоставляет информацию для определения точного положения флуорофора.
Переключая работу пончика с истощения на возбуждение, Хелл переворачивает с ног на голову сам принцип микроскопии сверхразрешения. Вместо того чтобы искать максимум потока фотонов, его новая техника определяет местоположение флуорофоров, ориентируясь на минимум. Поэтому он назвал свой новый трюк "пончик" MINFLUX.
Конечно, на практике для локализации используется более двух излучений. Однако каждое обнаруженное излучение сообщает движение пончика для определения положения флуорофора, что значительно снижает количество необходимых фотонов (примерно в 10 раз). Добро пожаловать в микроскопическую триангуляцию на основе пончика, не требующую фотонов. И что самое интересное? Этот новый пончик снижает разрешение еще в 10 раз, выводя нас на беспрецедентный одноразрядный наномасштаб. Молекулы теперь хорошо видны.
MINFLUX определяет совершенно новый класс методов сверхразрешения, который использует лучшее из STED-микроскопии и семейства локализации одиночных молекул
2D MINFLUX наноскопия субъединиц комплекса ядерной поры. NUP96-SNAP/SNAP-Alexa Fluor 647 являются эталонными структурами для тестирования световых микроскопов сверхразрешения. Сравнение изображений MINFLUX, STED и конфокальных изображений ясно показывает молекулярное разрешение MINFLUX.
Теперь, когда мы визуализируем молекулы, пришло ли время отправить пончик на пенсию, чтобы он служил микроскопии? Вряд ли. Следующий трюк в его изогнутом рукаве, вероятно, станет "пончиком всех пончиков". Разработчики работают над повышением точности локализации, увеличением соотношения сигнал/шум и восстановлением формы молекул по координатам флуорофоров. И хотя путь к этому проложат несколько технических достижений, пончик определенно будет среди них.
Любая технология, призванная раскрыть мир в дополнительных деталях, обречена на преодоление барьеров. По мере того как микроскописты все глубже погружаются в странный мир сверхмалых размеров, новая вариация пончика может стать очередным скачком через технологические рубежи. Пока же ясно одно: дифракционный предел Аббе - лишь пятнышко в зеркале заднего вида.
